La préparation d'échantillons biologiques tels que les os, les plantes, les muscles ou les crachats pour l'analyse de l'ADN, de l'ARN, des protéines ou des métabolites peut s'avérer être un défi. RETSCH propose des broyeurs de laboratoire qui broient et homogénéisent les échantillons solides, mais qui sont également adaptés à la désintégration cellulaire. Les broyeurs RETSCH sont utilisés, entre autres, dans les domaines de la biotechnologie, du diagnostic, de la médecine légale, de l'agriculture et de la microbiologie.
La désintégration cellulaire est souvent la méthode privilégiée pour extraire les composants cellulaires des bactéries, des levures, des champignons ou des microalgues, et est réalisée soit par des moyens chimiques, soit par des moyens mécaniques. Les méthodes mécaniques conviennent mieux aux cellules dont les parois sont tenaces ou lorsque les produits chimiques pourraient nuire à l'extraction et doivent donc être évités.
Une méthode courante et efficace est le bead beating, qui consiste à cisailler les cellules en suspension à l'aide de billes. Le bead beating peut être réalisé à petite ou à grande échelle dans différents flacons ou tubes. Il est possible de mélanger la suspension avec des billes et d'utiliser un mélangeur à vortex. Cependant, cette méthode est lente et incohérente, en particulier si le nombre d'échantillons est important ou si les temps de désintégration sont longs. L'utilisation de RETSCH vibro-broyeurs avec des adaptateurs qui automatisent le processus et le rendent rapide, efficace et reproductible, permet d'obtenir de meilleurs résultats.
Vibro-broyeur MM 400 - Désintégration des cellules de levure*
*La vidéo montre le modèle précédent avec un principe de fonctionnement identique.
Reproductibilité accrue de la concentration en protéines totales après désintégration des cellules, 7 min en
MM 400, 12 min Vortex.
Barres d'erreur : % de déviation standard
Cellules de Phaeodactylum tricornutum avant (à gauche) et après la désintégration cellulaire (à droite) avec le vibro-broyeur MM 400 en combinaison avec l'adaptateur Falcontube.
La température joue un rôle crucial, en particulier dans les applications impliquant des protéines sensibles à la température. Il existe une solution, le broyage cryogénique (voir paragraphe correspondant), et une autre, le refroidissement de la suspension cellulaire.
Pour le MM 400, il a été démontré que l'augmentation de la température dans les tubes de 2 ml est modérée, même à 30 Hz, un moyen simple consiste à faire des pauses de plus d'une minute, pendant lesquelles l'adaptateur avec les tubes est refroidi pendant une minute dans un bain de glace. De cette manière, la température reste inférieure à 12-15°C, en fonction de la taille des billes utilisées.
Augmentation de la température pendant la désintégration des cellules dans le MM 400 à 30 Hz, ou avec un Vortexer, refroidissement sur glace après chaque minute de désintégration des cellules.
Pour contrôler l'évolution de la température lors du bead beating, il est possible d'utiliser le broyeur vibrant MM 500 control. Un adaptateur spécial accueille dix-huit flacons de 2 ml à usage unique par lot. Le broyeur est relié à un refroidisseur d'eau réfrigérée à 4°C, qui refroidit à son tour l'adaptateur qui reçoit les flacons. De cette manière, la température de la suspension est maintenue à environ 13°C, sans les fastidieuses phases d'interruption manuelles dans un bain de glace. Bien que le MM 500 control ne puisse pas être utilisé avec l'adaptateur Falcontube à usage unique, il peut être utilisé avec des récipients de broyage en acier inoxydable d'un volume de 50, 80 ou 125 ml (voir exemple à gauche : P. pastoris).
Si le broyeur fonctionne avec de l'azote liquide et le CryoPad est réglé sur une température de 0°C, la température de la suspension cellulaire dans des tubes jetables de 2 ml peut même être maintenue à 0°C sans que la suspension ne gèle, ce qui permet de continuer à réaliser un bead beating efficace.
Il est parfois difficile de broyer complètement certains échantillons biologiques, comme les crachats de patients atteints de mucoviscidose ou les échantillons de tissus comme le foie, les poumons ou les tumeurs. Les récipients jetables de 2 ml sont souvent trop petits pour contenir le volume total de l'échantillon, de sorte que l'échantillon doit être divisé et réuni après le processus d'homogénéisation, ce qui représente une charge de travail et un temps supplémentaires pour les laborantins.
Les bols de broyage plus grands en acier inoxydable, par exemple, peuvent contenir le volume total de l'échantillon, mais doivent être nettoyés après chaque utilisation. Un adaptateur pour le broyeur vibrant MM 400 permet de résoudre ce problème en permettant l'utilisation de 5 tubes jetables de 5 ml, qui offrent une plus grande capacité et ne doivent pas être nettoyés. Dix échantillons peuvent être broyés simultanément par lot. Pour l'homogénéisation d'échantillons de tissus, il est également possible d'utiliser des Falcontubes de 50 ml. Dans ce cas, 8 échantillons par lot peuvent être traités en quelques minutes seulement.
Échantillon de foie avant et après homogénéisation dans le MM 400
Pour les échantillons collants, comme les baies, le broyage cryogénique est souvent la seule méthode efficace pour obtenir un échantillon homogène. Le tableau présente quelques exemples de matériaux d'échantillons qui ont été traités avec succès par broyage cryogénique dans le vibrobroyeur MM 400 ou le CryoMill. Il est possible d'utiliser des récipients en acier de 2 ml pour le broyage cryogénique dans le MM 400. Des effets similaires peuvent être obtenus dans le MM 500 control avec des récipients de broyage jusqu'à 125 ml pour des quantités d'échantillons plus importantes. Dans ce cas, il faut utiliser le CryoPad pour travailler avec de l'azote liquide. Pour les volumes d'échantillons plus petits, des récipients en acier inoxydable de 2 ml avec les adaptateurs correspondants sont également proposés pour tous les broyeurs mentionnés.
Tubes à essai de 2 ml en acier inoxydable
| Echantillon | Accessoires | Charge d'alimentation | Durée de broyage | Vitesse | Finesse finale max. (d90)/ |
| E. coli Bactéries |
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2 x 10 ml de boulettes de cellules congelées | 2 min | 30 Hz | désintégration complète des cellules |
| tissu musculaire |
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10 g | 4 min | 25 Hz | <150 µm |
| aiguilles de pin |
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3 min | 30 Hz | Extraction d'ARN reproductible à partir de 20 échantillons en une seule étape | |
| baies |
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2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| ongles |
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1 ongle par récipient | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| intestin de rat |
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1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
Morceaux de viande avant et après le broyage cryogénique
Baies collantes avant et après le broyage cryogénique
Aiguilles de pin avant et après le broyage cryogénique
Gel d'agarose pour la séparation de l'ARN des aiguilles de pin homogénéisées, reproductibilité élevée, quantité suffisante d'ARN préparé
Échantillon d'os avant et après broyage dans un broyeur à couteaux
Cheveux humains avant et après le broyage dans un vibro-broyeur
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Le bead beating est un procédé mécanique souvent utilisé pour la désintégration cellulaire afin d'obtenir l'extraction de composants cellulaires de micro-organismes tels que les bactéries, les levures, les champignons ou les microalgues. Dans cette technique, de petites billes cisaillent les cellules dans une suspension, ce qui peut être réalisé à différentes échelles avec différents récipients et tubes. L'automatisation par les vibrobroyeurs RETSCH avec adaptateurs automatise le bead beating et garantit que le processus se déroule rapidement, efficacement et de manière reproductible.
La taille optimale des billes et d'autres paramètres dépendent du type de cellules et ne peuvent être déterminés que par l'expérimentation. Le vibrobroyeur MM 400 peut par exemple traiter jusqu'à 20 échantillons dans des tubes Eppendorf de 1,5 ou 2 ml sans contamination croisée. Un adaptateur optionnel permet de recevoir jusqu'à huit tubes Falcon de 50 ml, ce qui augmente encore la polyvalence du processus.
La fragmentation cryogénique est indispensable lorsqu'il s'agit d'échantillons difficiles qui ne peuvent pas être homogénéisés dans les systèmes tampons traditionnels. C'est notamment le cas des plantes fibreuses, des veines résistantes, des ongles ou de certains tissus animaux ou tumoraux. Cette technique consiste à congeler les échantillons avec de l'azote liquide, soit avant, soit pendant le processus de broyage. Cela rend les échantillons cassants, ce qui facilite leur broyage en poudres homogènes.
Le processus de broyage cryogénique présente des avantages évidents, car les protéines ou les composés volatils qui pourraient se décomposer ou s'évaporer à des températures plus élevées sont conservés. En outre, il s'avère efficace pour broyer des organites intracellulaires dans certains organismes. Surtout, le broyage cryogénique est la seule méthode efficace pour obtenir des échantillons homogènes de matériaux collants comme les baies.
Pour obtenir des résultats optimaux, il est possible d'effectuer le broyage cryogénique avec des broyeurs de laboratoire spéciaux comme le CryoMill ou le vibrobroyeur MM 400, qui peut contenir des récipients en acier de 2 ml. Le broyeur vibrant MM 500 control, spécialement conçu pour travailler avec de l'azote liquide (LN2), peut accueillir des récipients de broyage plus grands, jusqu'à 125 ml.
Pour le broyage d'échantillons médico-légaux tels que les os ou les dents, les concasseurs à mâchoires ou les broyeurs à couteaux sont le meilleur choix pour la première étape du processus de broyage. RETSCH propose une gamme variée de broyeurs à couteaux pour le pré-broyage des matériaux d'échantillons les plus divers, dont des substances molles, moyennement dures, élastiques, coriaces et fibreuses. De nombreux accessoires permettent d'adapter parfaitement ces broyeurs aux différentes applications.
Le SM 300 polyvalent, par exemple, dispose de trois rotors différents et de tamis de fond de 0,25 mm à 20 mm ainsi que d'une vitesse variable de 100 à 3.000 min-1. Cette flexibilité permet d'adapter le broyeur aux exigences spécifiques des échantillons médico-légaux.
Pour les étapes de traitement suivantes, il convient d'utiliser des broyeurs à billes avec des billes de broyage présentant un diamètre supérieur à 5 mm, fabriquées dans des matériaux tels que l'acier, l'oxyde de zirconium ou le carbure de tungstène. Pour le broyage des cheveux, il est préférable d'utiliser des vibrobroyeurs comme le MM 400.
